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清兵初下江南，用高压政策强迫汉人归顺，致使各地起义烽烟不断。公元1659年夏，南明大将郑成功与张煌言合军，水陆大军17万，由海入江，志在收复南京。郑成功打到江宁(清改明应天府为江宁府)城下，哭祭明孝陵，却中了清朝两江总督郎廷佐诈降奸计，大败于白土山，不得不退兵厦门，后来转而收复台湾。
康熙与乾隆祖孙两代清帝，都曾六次巡幸江南。康熙五次祭祀明孝陵，对朱元璋行三跪九叩大礼，又四次校场阅兵；乾隆照样祭陵、阅兵，还遍游“金陵四十八景”，题字上百处。清廷笼络与炫耀武力兼施，江南局势终于稳定。南京成为统辖江南(包括今江苏、安徽)和江西的两江总督驻地。总督署设在汉府街(即今长江路292号，太平天国改建为天朝宫殿，通称天王府；民国时期为国民政府所在地)。督署东、西两座辕门，分别题额“三省钧衡”和“两江保障”，表明清廷倚为江南枢要，控制东南半壁。
清前期，江宁丝织进入鼎盛时期，织机3万多台、织工超过5万，城南秦淮河两岸，为机户集中之地；丝织业的繁荣，带动了相关20多个行业。在此情况下，清廷专设了江宁织造一职，兼管官营、民营丝织业，以供奉朝廷，其实都是皇帝亲信重臣，直接听命于皇帝，收集情报，监督地方官员，事权远过于丝织一业。
1840年中英鸦片战争爆发。英军沿海北上，溯江直入心腹要地。1842年8月5日，英舰80余艘侵入南京江面，英军登陆，摆出攻城架势。尽管江宁郊区人民已在英勇抗击，清廷钦差耆英、伊里布仍乘小船登英舰求和。8月24日，清廷钦差备轿江边，把英国侵略军代表抬到静海寺“议约”；29日，又在英舰“康华丽”号上俯首签订了中国近代史上第一个丧权辱国的不平等条约——《中英江宁条约》(又称《南京条约》)。中国沦为半封建半殖民地的惨痛历史，由此开始。
1853年春天，太平天国农民起义军在天王洪秀全、东王杨秀清率领下，水陆两路，从武昌循江东下，以到金陵“登小天堂”为号召，直取江宁。3月19日，攻占江宁，遂定都，称天京。定都天京后，太平天国颁布了中国历史上第一个农民运动纲领《天朝田亩制度》，提出了政治、经济、民族和男女平等的主张，虽然没能真正实行，却反映了农民民主意识的觉醒。太平天国建都南京11年，遗存史迹以洪秀全驻跸的天朝宫殿和堂子街太平天国壁画最为著名。
太平天国运动失败以后，南京又重新成为清王朝两江总督驻节之处。从19世纪60年代起，随洋务运动开展，江宁出现了第一批军火、电力、机器工厂，西方近代科技在全国较早地引进了古城南京。铁路、轮船、西式医院和学堂相继在南京出现。开全国高等师范教育之先河的两江师范学堂、规模居全国23行省之冠的江南贡院、重金收购丁丙八千卷楼藏书始建的江南图书馆等，也在这一时期构建起南京文化教育的新局面。
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